Februar06

Wenn es in der CFS-Forschung um das Auffinden eines biologischen Markers geht, dann verspricht ein multidisziplinärer Ansatz die größte Hoffnung auf Erfolg. Bei den Centers for Disease Control and Prevention CDC arbeitet ein Team verschiedener Spezialisten zusammen, um die Erkenntnisse auf dem Gebiet der Genomik und der Proteomik zu integrieren mit dem Ziel, die Pathogenese der Erkrankung zu verstehen und um therapeutische und vorbeugende Strategien zu entwickeln.

Suzanne Vernon, Ph.D., ist die Leiterin der Arbeitsgruppe des Molecular Epidemiology Program der Centers for Disease Control and Prevention, CDC. Sie arbeitet mit einem multidisziplinären Team von 14 intern und 10 extern tätigen Forschern zusammen, die versuchen, das Rätsel CFS zu lösen. Suzanne Vernon (rechts) ist hier zusammen mit Toni Whistler zu sehen, dem leitenden Forscher und Labormanager der Forschungsarbeiten im Bereich Genomik bei CFS.

Diejenigen unter uns, die ihre wissenschaftlichen Karrieren der Erforschung des Chronic Fatigue Syndroms (CFS) widmen, stellen sich der großen Herausforderung, aus vielen einzelnen Teilen das vollständige Bild einer der komplexesten Krankheiten zusammenzusetzen. Bevor wir die vollständige Sequenz des menschlichen Genoms kannten, haben die Wissenschaftler immer nur einige wenige Gene auf einmal untersucht. Noch vor einem Jahrzehnt waren nur etwa 500 Gene der Erforschung frei zugänglich. Wir versuchten damals, ein Bild aus 30.000 Puzzleteilen aus nur 500 Teilen zusammenzusetzen. Dann stieg die Zahl der Teile, die uns zur Verfügung standen, auf 3.800 (Gene) an. Heute liegen mit der Vervollständigung der Sequenz des humanen Genoms schließlich alle Teile dieses riesigen Puzzles vor uns.

Jetzt können wir alle Gene des menschlichen Genoms untersuchen, d.h. die Aktivität dieser Gene und wie die Zehntausende von Genen und Proteinen zusammenarbeiten, um den Körper in einem Zustand von Gesundheit und Wohlbefinden zu erhalten. Das ist eine aufregende und gleichzeitig ernüchternde Aufgabe. Das CFS-Labor der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) untersucht derzeit die Aktivität der 30.000 Gene von 200 CFS-Patienten, die an einer in Wichita (Kansas, USA) durchgeführten Studie teilgenommen hatten. Zum Glück haben wir gelernt, mit der überwältigenden Datenmenge umzugehen, die sich aus der Gensequenzierung ergibt, und wir haben auch die entsprechenden Rechnerkapazitäten, um aus diesen Daten sinnvolle Schlüsse ziehen zu können. Innerhalb des nächsten halben oder ganzen Jahres hoffen wir die Pfade in den mononukleären Zellen des peripheren Blutes einkreisen zu können, die verändert oder anormal sind.

Der Bereich der molekularen Epidemiologie war innerhalb des CFS-Programms der CDC vor sieben Jahren mit der Absicht gegründet worden, mit Hilfe großer Anstrengungen im Bereich von Laboruntersuchungen der Entdeckung eines Biomarkers näherzukommen und die Pathophysiologie des CFS zu erforschen. Diese Arbeit sollte eng mit dem Bereich Epidemiologie des CFS-Programms vernetzt werden.

Seitdem hat man einige Jahre Arbeit in die Erforschung, Entwicklung und Optimierung von leistungsstarken, neuen Technologien auf dem Gebiet der Genomik und Proteomik gesteckt. Wir haben gezielt solche Methodologien ausgewählt, mit denen Forschungsansätze und Hypothesen generiert werden konnten, denn zuvor waren weder die Ätiologie noch ein Biomarker für CFS identifiziert worden.

Um den Reichtum und die Komplexität würdigen zu können, den uns das menschliche Genom im Rahmen unserer CFS-Forschung bietet, ist es zunächst sinnvoll, einen Überblick über die grundlegende Aspekte der Genombiologie zu geben. Das Genom ist aufgebaut aus der DNA, einem Molekül, das sich aus vier Substanzen zusammensetzt, die mit den Buchstaben A (für Adenin), T (für Thymin), G (für Guanin) und C (für Cytosin) bezeichnet werden. Man kann sich die DNA also als ein Alphabet mit vier Buchstaben vorstellen. Mit diesen vier Buchstaben werden nun „Sätze“ gebildet: die Gene. Man schätzt, dass das menschliche Genom aus mindestens 30.000 Genen besteht. Die DNA dieser Gene kann aktiv werden, d.h. aus der DNA Boten-RNA (Ribonukleinsäure) produzieren. Diese Aktivität wird als Transkription bezeichnet und ist der Zwischenschritt zur Herstellung eines Proteins nach dem im Gen festgelegten Bauplan.

Wir messen die Genexpressionsaktivität in dem Versuch, Marker für CFS zu identifizieren und damit unser Verständnis von der Pathogenese der Krankheit zu vertiefen. Die Genexpression ist ein wichtiger Schritt, aber sie liefert nicht unbedingt alle Informationen, die notwendig sind, um CFS zu verstehen. Um unsere Suche nach einem Biomarker für die Krankheit zu vervollständigen, untersuchen wir deshalb auch die Proteine des Blutes, also das Ergebnis der Genexpressionsaktivität. Diese Erfassung der Proteine nennt man Proteomik.

Unsere Forschungsanstrengungen beruhen auf der Annahme, dass man das periphere Blut als repräsentative Stichprobe für den systemischen Zustand nutzen kann und damit eine Beurteilung verschiedener pathologischer und physiologischer Pfade möglich ist, die mit der Erkrankung einhergehen oder diese vielleicht verursachen. Diese Prämisse leitet sich aus der Tatsache ab, dass jeder von uns etwa fünf Liter Blut hat, das ständig durch unseren Körper strömt. Das periphere Blut ist voll mit einer Vielzahl von Zelltypen, die man als mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PLB) bezeichnet. Jeder dieser Zelltypen hat eine bestimmte Aufgabe. Diese Zellen wandern durch unseren Körper, d.h. auch zum zentralen Nervensystem. Sie helfen, ein Gleichgewicht, eine Homöostase, aufrechtzuerhalten oder verursachen eventuell eine über das Immunsystem vermittelte Symptomatik.

Wenn wir also die Aktivität der Gene der peripheren Zellen des Blutes messen, dann erwarten wir, dass wir damit einen Marker für CFS bestimmen und vielleicht sogar die beteiligten pathophysiologischen Prozesse herausfinden können. Sowohl die zellulären als auch die flüssigen Bestandteile des peripheren Blutes sind eine reichhaltige Quelle von Informationen, um das Rätsel der Ursache des CFS zu lösen.

Das CFS-Programm Molekulare Epidemiologie der Centers for Disease Control

beschreibt seine Ziele wie folgt:

„Im Rahmen des CFS-Programms Molekulare Epidemiologie werden epidemiologische Daten mit leistungsfähigen molekularen und genomischen Technologien kombiniert, um nach Markern und Untergruppen bei CFS zu suchen und ein Verständnis für die zugrundeliegenden biologischen Korrelate zu gewinnen. Das Ziel des Molecular Epidemiology Program ist, CFS auf der Ebene der biologischen Systeme zu charakterisieren, indem die Erkenntnisse der Genetik, der Proteomik, der Physiologie und der bevölkerungsbasierten Epidemiologie kombiniert werden. Bis jetzt haben wir uns auf die Erstellung von Genexpressionsprofilen konzentriert. Das ist eine Methode zur Untersuchung der Aktivität bzw. der Transkription von Genen, indem die Boten-RNA (http://www.ngfn.de/glossar534.htm) in den Zellen analysiert wird. Die Genexpression wird durch viele Faktoren verändert, z B. die Zell-Differenzierung, Stoffwechselvorgänge und Krankheiten. Indem man die Genexpressionsprofile verschiedener Proben vergleicht, können charakteristische Unterschiede festgestellt werden. Diese Unterschiede, die sogenannte differentielle Genexpression, kann auf Marker für eine Diagnose oder veränderte physiologische Pfade hinweisen.

Mikroarrays ermöglichen die gleichzeitige Entdeckung und Untersuchung von Hunderten oder Tausenden von expremierten Genen, ein Ansatz, der entscheidend ist, um biologische Pfade und Prozesse zu verstehen. Die meisten Genexpressions-Studien haben sich auf Proben konzentriert, die man aus Zellen oder Geweben mit einer bekannten Läsion gewonnen hat. Bei Krankheiten wie CFS gibt es jedoch keine bekannte Läsion, von der man eine Probe entnehmen und die man untersuchen könnte. Deshalb ist es entscheidend, alle Aspekte der Labortestung streng zu standardisieren. Der Großteil der Arbeit der CDC hat sich bis jetzt auf die Standardisierung der Assays konzentriert.“

(Aus: http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/cfs/publications/molecular_epi.htm)

Dort finden sich die Abstracts der bisherigen Veröffentlichungen zu diesem Thema.

Bevor ich die Informationen, die uns die Genaktivität und die Proteinanalyse liefern, erläutere, möchte ich kurz auf die Technologien eingehen, die bei diesen Verfahren eingesetzt werden. Um die Genaktivität der peripheren Blutzellen zu messen, benutzen wir eine Technologie, die als Mikroarray-Technologie oder als Erstellung von Genexpressionsprofilen bezeichnet wird. Man muss hier erwähnen, dass die Mikroarray-Technologie angepasst werden musste, um sie für den Einsatz an menschlichen Blutproben geeignet zu machen, denn diese sind sehr wertvoll und nur sehr begrenzt verfügbar. So entnehmen wir beispielsweise bei Menschen routinemäßig nur 10 Milliliter Blut. Als wir 1998 begannen, mit der Mikroarray-Technologie zu arbeiten, brauchten wir aber das Äquivalent von einem Liter Blut, also hundertmal mehr, als uns zur Verfügung stand!

Die Optimierung der Mikroarray-Technologie für den Einsatz an den begrenzten humanen Proben hat uns mehrere Jahre Arbeit gekostet, aber jetzt haben wir sie zu einer wahren Kunst entwickelt. Nach der Entnahme einer normalen venösen Blutprobe isolieren wir zunächst die Zellen des peripheren Blutes. Diese Zellen, die einem Ballon ähneln, werden aufgesprengt und die RNA aller Gene, die aktiv sind, wird isoliert. Damit erhalten wir Tausende von RNA-Molekülen, die die Aktivität der schätzungsweise 30.000 Gene unserer DNA repräsentieren.

Um aus den RNA-Molekülen, die wir jetzt in einem Reagenzglas aufgefangen haben, irgendwelche Schlüsse zu ziehen, müssen wir sie uns jedoch ansehen können. Die einzige Möglichkeit, RNA-Moleküle sichtbar zu machen ist, sie irgendwie zu markieren, so dass wir sie anschließend entdecken können. Zu diesem Zweck machen wir von jedem RNA-Molekül eine Kopie. Während dieses Kopierprozesses werden Detektormoleküle hinzugefügt, die uns ermöglichen, diese RNA-Kopien zu sehen, bzw. zu entdecken. Das ermöglicht es uns dann, die Genaktivität zu messen.

Um zu verstehen, wie die Genaktivität gemessen wird, muss man sich in Erinnerung rufen, dass die RNA-Moleküle von der DNA abstammen und damit die Aktivität der DNA abbilden. Deshalb ist die RNA komplementär zu dem Gen, von dem es abgeleitet ist und heftet sich an das komplementäre Gen in ähnlicher Weise, wie sich die zwei Teile eines Reißverschlusses ineinander fügen. Hier erweist es sich nun als sehr nützlich, dass wir die komplette Sequenz des humanen Genoms kennen. Weil wir die Sequenz aller Gene des menschlichen Genoms kennen, können wir Teile dieser DNA-Moleküle synthetisch herstellen und sie auf einen Objektträger für ein Mikroskop auftragen. Das Ergebnis ist ein Objektträger mit den 30.000 entdeckten Genen, die systematisch angeordnet sind. Aus dem englischen Wort für „Aufstellung“, „Anordnung“, „Reihe“ – dem Begriff „array“ – leitet sich der Begriff Mikroarray ab, der auch im Deutschen verwendet wird.

Nun verfügt der Forscher auf der einen Seite über ein sogenanntes Mikroarray mit allen bekannten Genen und auf der anderen Seite über eine mit Detektormolekülen markierte RNA-Probe eines CFS-Patienten, so dass nun in einem Reagenzglas die gesamte unbekannte Genaktivität enthalten ist. Die markierte RNA-Probe wird auf den Mikroarray-Träger aufgetragen, und weil die RNA zur DNA komplementär ist, heften sich die Genmoleküle an das Gen an, von dem sie sich abgeleitet haben. Man bezeichnet dieses Anheften auch als „hybridisieren“. Die markierte RNA, die hybridisiert, wird mit Hilfe von Licht aufgespürt, und dabei entspricht das Ausmaß der Genaktivität direkt der Intensität des Lichtes. Die Intensität des Lichtes, die die Genaktivität repräsentiert, wird auf diese Weise für jedes der 30.000 Gene auf dem Mikroarray analysiert und verglichen.

Die Messung der Genaktivität der 30.000 Gene bildet nun ein Genexpressionsprofil für jede der von uns untersuchten Personen. Die Genexpressionsprofile werden nun miteinander verglichen, und mit Hilfe von ausgeklügelten analytischen Techniken werden ähnliche Genexpressionsprofile zu Gruppen zusammengefasst. Tatsächlich hat uns die Erstellung von Genexpressionsprofilen mit Hilfe der Mikroarray-Technik gezeigt, dass bei Menschen mit CFS mehrere Gene eine andere Aktivität zeigen als bei nicht erschöpften Kontrollpersonen. Mit quantitativen analytischen Techniken kann man die Gene herausfinden, die bei Menschen mit CFS eine höhere oder niedrigere Aktivität aufweisen. Die Genexpressionsprofile der peripheren Zellen des Blutes sagen uns also, wie der Körper aus der „Sicht“ der Blutzellen auf die Krankheit reagiert. Die Unterschiede in der Genaktivität geben uns Hinweise darauf, was bei CFS-Patienten möglicherweise schief läuft.

So wissen wir beispielsweise, dass die Zellen des peripheren Blutes durch den Körper wandern, um auf mit Stress verbundene Auslöser – eine Infektion z.B. – zu reagieren. Wenn eine der Ursachen von CFS die Unfähigkeit der der Blutzellen sein sollte, hier angemessen zu reagieren, dann könnten wir erwarten, dass wir Unterschiede in der Genaktivität der Signalwege sehen. Selbst wenn die primäre Ursache des CFS nicht in den Blutzellen, sondern irgendwo anders im Körper zu finden ist, dann dienen die peripheren Blutzellen als Wachposten der Krankheit, die uns Hinweise darauf geben können, wo im Körper das eigentliche Problem liegt.

Das Blut ist in der Tat eine reiche Quelle an Informationen, sowohl bei der Untersuchung der Zellen als auch bei der Untersuchung der Flüssigkeit des Blutes, die wir als Serum bezeichnen. Das Serum enthält Proteine und Proteinfragmente von jeder Zelle des Körpers. Wir messen die Serumproteine, um eine Bewertung der Genaktivität des gesamten Körpers zu erhalten. Dazu setzen wir eine Technologie ein, die wir als SELDI-TOF-Technologie (surface enhanced laser desorption ionization time of flight) bezeichnen. (Es handelt sich hier um eine Methode der Massenspektrometrie, mit der sich komplexe Proteinzusammensetzungen erfassen lassen – d.Ü.) Auch wenn der Name lang und kompliziert ist, so ist doch die Technologie ein wunderbar einfacher Zugang, der darauf hinausläuft, dass man Proteine mit einem Laser „abschießen“ kann, um zu sehen, wie lange es dauert, bis sie zum Detektor fliegen. Aus dieser Flugzeit bestimmt sich die genaue Größe eines Proteins. Und wenn wir die Größe kennen, können wir sagen, um welches Protein es sich handelt.

Die Proteomik, also die Erstellung von Proteinprofilen, wie ich sie gerade beschrieben habe, ist eine der erfolgversprechendsten Techniken, um einen diagnostischen Marker für CFS zu entdecken. Warum ist das so? Weil das Blutserum die „flüssige Abfalldeponie” für alle Organe und Zellen des Körpers ist. Wenn wir die Serumproteine von Menschen mit CFS mit denen von nicht erschöpften Kontrollpersonen vergleichen, dann werden wir die Unterschiede feststellen können. Außerdem kann diese Information über die Proteine mit der Information über die Genaktivität verknüpft werden, um herauszufinden, was diese Unterschiede verursacht.

Sie werden vielleicht fragen, wieso wir, obwohl wir über all diese wunderbaren Technologien verfügen und schon mehr als ein Jahrzehnt CFS-Forschung betreiben, die zu mehr als 3.000 durch Fachleute überprüften wissenschaftlichen und medizinischen Publikationen geführt hat, es keine eindeutigen körperlichen Anzeichen, keine im Labor feststellbaren Anomalien oder bekannten Krankheitsursachen gibt. Eine der wahrscheinlichsten Ursachen hierfür ist, dass es keine bekannte oder zugängliche Läsion gibt, die man prüfen könnte. Die Forscher haben eine Reihe biologischer Proben wie etwa Urin, Muskelfasern, Blut und Speichel auf der Suche nach Hinweisen auf die Ursache dieser behindernden Erkrankung untersucht. Wir wissen, dass CFS nicht die Folge einer einzelnen Genmutation oder eines einzelnen Umweltfaktors ist. Das macht es so schwer, das Rätsel des CFS zu lösen. Wir werden die klinischen, epidemiologischen und molekularen Informationen miteinander verknüpfen müssen, um CFS zu verstehen.

Es ist unwahrscheinlich, dass eine Forschergruppe oder eine Disziplin allein das Rätsel CFS lösen wird. Die Krankheit ist wahrscheinlich das Ergebnis einer Reihe verschiedener Auslöser oder der Störung bzw. des Zusammenbruchs mehrerer Systeme. Aus diesem Grund ist die Arbeitsgruppe CFS bei den CDC multidisziplinär zusammengesetzt und umfasst Immunologen, Neurologen, Molekularbiologen, Epidemiologen, Psychologen und Endokrinologen. Wir müssen die einzelnen Daten, die uns bis jetzt über die Patientenpopulation vorliegen, die Forschungsergebnisse aus den verschiedenen Disziplinen und das grundlegende Wissen, das wir aus den 3.000 vorliegenden Studien gewonnen haben, verknüpfen, damit wir die genomischen und proteomischen Informationen entschlüsseln können, die wir jetzt zusammentragen.

Bereits vor der Vervollständigung der humanen Genomsequenz hat das Molecular Epidemiology-Program der CDC erfolgreich zeigen können, dass man mit der Messung von etwa 1.600 Genen denGroßteil der Menschen mit CFS von gesunden, nicht erschöpften Menschen unterscheiden konnte. Obwohl diese Studie aufgrund der kleinen Anzahl der untersuchten Gene begrenzt war, zeigte sie doch, dass man anhand des peripheren Blutes die unterschiedlich expremierten Gene bei CFS herausfinden kann.

Wir haben darüber hinaus gezeigt, dass die Aktivität von etwa 100 Genen sich bei Menschen mit plötzlichem Krankheitsbeginn von denen mit allmählichem Krankheitsbeginn unterscheidet. Wir konnten auch aufzeigen, dass sich die Genaktivität bei Menschen mit CFS als Reaktion auf eine körperliche Herausforderung sich von der bei einer Infektion unterscheidet. In diesen beiden Studien wurde die Aktivität von 3.800 Genen untersucht. Sie werden zur Zeit beide für eine Veröffentlichung vorbereitet.

Ich hoffe, dass die hier beschriebene Arbeit Ihnen eine Vorstellung von unserem CFS-Programm und seinen Zielen und ein Verständnis davon vermittelt, wie diese Fortschritte das CFS-Programm der CDC in Richtung datengestützter Experimente vorantreiben werden. Es ist dieser systematische und methodische Forschungsansatz, der uns die besten Möglichkeiten zur Entwicklung diagnostischer Instrumentarien und therapeutischer und präventiver Strategien für CFS liefert.

* Dieser Artikel erschien zuerst in englischer Sprache unter dem Titel „Unraveling the Cause of CFS in the Post-Genomic Era“ in der Herbst-Ausgabe des CFIDS-Chronicles 2004. Dieses Heft kann als pdf-Datei unter dieser Adresse heruntergeladen werden: http://www.cfids.org/archives/2004/2004-4fall-toc.asp

Der CFIDS-Chronicle ist die regelmäßig erscheinende Zeitschrift der größten Patientenorganisation der USA, der CFIDS Association. Diese Patientenorganisation unterhält eine sehr informative Website unter http://www.cfids.org/

The CFIDS Association of America
PO Box 220398
Charlotte, NC 28222-0398
704-365-2343

Die Übersetzung und die Veröffentlichung auf dieser Website erfolgt mit freundlicher Genehmigung der CFIDS Association.

Über eine neue Studie dieser Forschergruppe wird in Teil IV berichtet. Die Forschungsarbeiten von Jonathan Kerr und John Gow zu Genexpressionsprofilen bei CFS werden in Teil II und Teil III dargestellt.

Weitere Informationen zum Programm der CDC zu Genexpressionsprofilen bei CFS finden sich im Artikel von Dorothy Wall, dem Artikel des Monats November.

Das Rätsel lösen:

die Ursache des CFS im Post-Genom-Zeitalter *

Was ist....